Геномные базы данных как инструмент создания диагностических систем

Геномика – это новое направление науки, объектом изучения которой является геномы всех организмов, а не только человека. К 2013 г. в геноме человека было обнаружено более 1112 «генов болезней» (то есть генов, мутации в которых имеют следствием за болевания) и еще более 94 «составляющих» гена, образующиеся при опухолевых перестройках генома. На сегодня, раскрыты механизмы тех заболеваний, которые обусловлены белок-кодирующей частью гена.

Уже выяснено, в каком месте генома человека надо искать мутац ии, вызываемые ожирение у человека. Проверка этого участка генома человека у больных людей и сравнение его с той же нуклеотидной последовательностью у здоровых людей подтвердила, что мутации этого гена у человека, как и у мышей, приводят к ожирению. Базы д анных геномов создаются для быстрого по иска информации про локализованные генетические маркеры у конкретного биологического вида и гомологичных генов у разных видов. Кроме того, базы данных геномов призваны отражать общую картину изученности геномов картир ованных видов, включая информацию о мутантных фенотипах, которая необходима для генетического картирования. Геномные базы данных являются, как правило, частными инициативами и большинство из них обновляется очень нерегулярно. Это неважно, если геном, котор ый они отражают, картируется неинтенсивно. В противном случае есть риск встретить в них устаревшую информацию, которая не отражает истинного положения вещей. Так, в первую очередь (для интенсивно картированных геномов), необходимо убедиться в частой обновл яемости базы данных. Как правило, такая информация содержится на главной интернет-странице (Home page) сайта.

Существуют также базы данных геномов для ряда других организмов. Некоторые из них построены однотипно, но есть и те, которые значительно отличают ся по своей структуре геномных баз данных. Сейчас создатели геномных баз данных стремятся выработать единый тип интерфейса, максимально удобный для пользователей. Это привело к созданию семейств ARKbd баз данных сельскохозяйственных животных и разработки к омпьютерной программы для базы данных геномов ACEDB, с использованием которой создано большинство геномных баз данных растений, прокариот и червей. Все вышеизложенное определило актуальность курсовой работы.

Целью курсовой работы является рассмотрение гено мной базы данных в качестве инструмента создания диагностических систем. Исходя из указанной цели, можно выделить частные задачи, поставленные в курсовой работе:

1. Изучить особенности организации геномов прокариот, эукариот и человека.

6 стр., 2594 слов

Объектно-ориентированные базы данных. _Объектно-ориентированные_БД. ...

... объект может принадлежать только одному классу (не учитывая механизм наследования). Объектные базы данных обычно используются в приложениях, которые требуют высокой производительности, сложных расчетов и ... объект или экземпляр, такой как клиент, человек или автомобиль. Узел эквивалентен записи в системе реляционной базы данных. Ребро в базе данных графа представляет отношение, которое соединяет ...

2. На основе анализ а литературы выявить содержание геномных баз данных как инструмента создания диагностических систем, основные направления работы в данной области.

3. Рассмотреть основные геномные базы данных.

Для решения поставленных задач курсовой работы использовались с ледующие методы исследования:

Теоретический анализ научной литературы.

Анализ и обобщение основных технологий генной инженерии.

Объектом исследования в курсовой работе являются геномные базы данных.

Предметом исследования в курсовой работе являются техноло гии генной инженерии, применяемые для создания геномных библиотек.

23

21000

* Для эукариот размер генома и количество молекул отображают половину ДНК в клеточном ядре.

Вирусные геномы построены чрезвычайно «экономно»: кодирующие участки генов занимают практически всю, сравнительно небольшую, вирусную ДНК. В геноме прокариотической клетки количество ДНК и генов значительно возрастает, но сохраняется принцип экономичности по использованию большинства последовательностей для кодирования генетической информации. Например, геном Escherichia coli представлен одной циркулярной молекулой ДНК (так называемой бактериальной хромосомой) длиной 4600000 пар оснований. Около 90 % этой ДНК приходится на кодирующие последовательности ~ 4,1 тыс. белковых генов и ~ 120 генов РНК, которые не транслируются.

Эукариотические геномы содержат значительно большее количество ДНК в сравнении с геномами прокариот, причем подавляющее часть этой ДНК представлена ​​не кодирующими последовательностями. В том числе, примерно половина эукариотического генома – это последовательности, представленные многими копиями (последовательности, которые повторяются).

Эукариотической ДНК находится в клеточном ядре в составе хромосом, каждая хромосома содержит одну гигантскую линейную молекулу ДНК. Последовательности, повторяющиеся сосредоточены, в частности, на концах хромосом (теломеры) и в зонах прикрепления хромосом к веретена разделения при митозе и мейозе (центромеры).

Характерным признаком генов эукариот (в отличие от прокариот) является мозаичный принцип строения кодирующей части (рис. 1): собственно кодирующая часть представлена ​​последовательностью отдельных содержательных участков – экзонов, разделенных бессодержательными интронами. Часто эк-зоны соответствуют отдельным структурным доменам мультидоменных белков: эволюционный сбор белка из кубиков-доменов может осуществляться путем перетасовки экзонов на уровне ДНК. Бессодержательные интроны есть в том смысле, что не несут информации о конечном продукте, но в пределах интронов часто расположены важные регуляторные участки. Кроме того, интроны некоторых генов могут содержать другие гены со своими интронами и экзонами. При транскрипции молекула РНК синтезируется полностью (первичный продукт транскрипции – первичный транскрипт – имеет в своем составе экзоны и интроны).

Итак, необходимым этапом экспрессии гена является процесс сплайсинга – вырезания интронов и сшивания экзонов в конечный транскрипт, который уже может быть использован как матрица для синтеза белка. При этом сплайсинг может быть направлен по разным путям – альтернативный сплайсинг, — что приводит к образованию различных конечных продуктов – различных белков.

12 стр., 5966 слов

Что такое ген? Генетическая точка зрения

... чрезвычайно длинную последовательность ДНК, содержащую множество линейно расположенных генов. Довольно долго оставалось загадкой, сколько всего генов существует в геноме. Представление о том, что каждый ген может существовать ... гибридов образуются те же численные соотношения, как и при полном доминировании, хотя вместо л чух фенотипов можно различить три. Независимость различных генов Во втором ...

Рис.1. Мозаичное строение кодирующей части гена и схема образования различных мРНК (ломаные линии – интроны, которые вырезаются) в следствие альтернативного сплайсинга

Общее количество генов в геномах высших эукариот варьирует примерно от 20 до 30 тыс. Как показано на рис. 2 кодирующие последовательности этих генов занимают лишь ~ 1,5 % генома. Остальные приходятся на межгенную ДНК (где расположены также регуляторные участки), интроны (~ 30 %) и более половины генома составляют последовательности, которые повторяются.

Рис. 2. Приблизительный относительный состав последовательностей различных типов в эукариотическом геноме

Основные типы повторов, присутствуют в геноме высших эукариот:

  • гены, представленные несколькими (а иногда до 1 тыс.) копий. Часто гены, которые повторяются, сгруппированы в кластеры, т.е. находятся рядом друг с другом;
  • псевдогены – последовательности, которые гомологичные определенным генам, но не экспрессируются.

К их появлению приводят, например, нарушение части генов, которые повторяются: неповрежденные гены берут на себя функцию поврежденных, а последние так и остаются в геноме;

  • многократные повторы коротких последовательностей (тандемные повторы), часть которых распределена по всему геному, но большинство сосредоточено в теломерных и центромерных зонах хромосом;

— интерсперсные (диспергированные) мобильные элементы, способные к перемещению и размножению в пределах генома. Мобильные элементы занимают значительную часть эукариотического генома (от 30 до 50 %), но распределены в геноме неравномерно: есть длинные участки, которые на 90 % представлены мобильными элементами, и такие зоны, где интерсперсные элементы отсутствуют. В целом наблюдается отрицательная корреляция между плотностью генов и мобильных элементов.

2 Генная инженерия и ее методы

Формальной датой рождения генной инженерии можно считать 1972 г., когда Берг (Paul Berg) и его сотрудники получили первую рекомбинантную ДНК, состоящую из ДНК вируса SV40 и бактериофага λ. Совершенствование технологии рекомбинантных ДНК и связанных с ней методов сыграло большую роль в развитии молекулярной генетики и молекулярной биологии в целом: структура и функции практически любого гена и продуктов его экспрессии стали доступны для исследования, появилась возможность осуществлять изучение огромных геномов высших организмов и систем их регуляции. Современные подходы для осуществления различных манипуляций с молекулами ДНК является сегодня не только главным инструментарием для фундаментальных исследований в области молекулярной генетики, но и основой для развития новых биотехнологий, базирующихся на генетической модификации микроорганизмов, растений и животных как продуцентов продуктов питания и биологически активных соединений.

2.1 Основные ферменты генной инженерии

Главным инструментом для осуществления генно-инженерных операций являются природные ферменты, которые катализируют реакции деградации и синтеза нуклеиновых кислот. Особое место среди них принадлежит рестриктным эндонуклеазам (рестриктазам), которые осуществляют специфическое разрезание молекулы ДНК внутри определенных элементов последовательности нуклеотидов. Рестриктазы (существует несколько сотен таких ферментов) выполняют в бактериальных клетках роль защиты от чужеродной ДНК бактериофагов. Названия этих ферментов образуются по такому принципу: первая большая буква обозначает род микроорганизма, две маленькие – вид, римские цифры и иногда большие буквы – порядковый номер рестриктазы среди других рестриктаз данной бактерии. Например, EcoRI – рестриктаза RI с Escherichia coli.

9 стр., 4347 слов

Генная инженерия за и против

... последовательности) по праву можно считать центральным звеном в технологии генной инженерии. Датой рождения генной инженерии ... впервые выделен ряд ферментов – рестриктаз, пригодных для генно-инженерных целей. ... последовательности нуклеотидов в хромосомной ДНК, выпадение одних и включение других нуклеотидов ... процедуру утверждения. Они позволяют использовать крайне нечувствительные методы проверки ...

Последовательности нуклеотидов, которые узнаются рестриктазами, отличаются большим разнообразием: сайтом рестрикции являются небольшие (4, 6, иногда чуть больше пар оснований) палиндромные последовательности (такие, что читаются одинаково в направлении 5′-3′ по обеим цепям, рис. 3).

В зависимости от типа рестриктазы, два разреза, которые она осуществляет, могут быть расположены точно друг напротив друга в двух цепях, что обуславливает образование так называемых тупых концов. Чаще рестриктазы оставляют взаимно комплементарные 5′-концевые (иногда 3′-концевые) одноцепочечные выросты – липкие концы (рис. 3).

Рис. 3. Примеры рестриктных сайтов (слева, стрелками обозначены места разрезов) и продуктов рестрикции (справа).

Рестриктазы ВаmHI и NotI оставляют липкие концы с 5′-концевымивыступами, HpaI – тупые концы

Кроме того, часто используют различные менее специфические нуклеазы – ферменты, катализирующие реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. Нуклеазы могут действовать только на молекулы ДНК (ДНКазы) или РНК (РНКазы); избирательно гидролизировать только одноцепочечную (нуклеаза S1) или двухцепочечную (экзонуклеаза ІІІ) молекулу ДНК; действовать только на гибридную молекулу РНК-ДНК (РНКаза Н).

Следующий важный для генной инженерии фермент – ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Чаще всего используют ДНК-полимеразу І E. coli. Ей присущи три вида каталитической активности:

  • полимеразная, что приводит синтез цепи ДНК в направлении 5′-3′ на одноцепочечной ДНК матрице в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатов и короткого ДНК праймера, имеющего свободную 3′-гидроксильную группу;
  • 3′-экзонуклеазная, что вызывает отщепление нуклеотидов от 3′-конца с целью редактирования ошибок;
  • 5′-экзонуклеазная, что обеспечивает отщепление нуклеотидов от 5′-конца полинуклеотидной цепи.

За счет первой и третьей активностей ДНК-полимераза I одновременно может катализировать реакцию полимеризации и гидролиз нуклеотидной цепи в направлении 5′-3′, начиная с одноцепочечного разрыва в двухцепочечной ДНК. Такой процесс называется ник-трансляцией: при этом разрыв (ник) перемещается вдоль цепи ДНК в направлении 5′-3′ на расстояние до одной тысячи пар нуклеотидов. Ник-трансляцию используют, в частности, для введения в ДНК радиоактивно меченых нуклеотидов.

От ДНК-полимеразы I с помощью трипсина или субтилизина можно отделить большой фрагмент (фрагмент Кленова), который сохраняет только полимеразную и 3′-экзонуклеазную активности. Отсутствие 5′-экзонуклеазной активности позволяет, в частности, использовать фрагмент Кленова для «заполнения» одноцепочечных 5′-концевых выступов, которые образуются при разрезании ДНК рестриктазами.

17 стр., 8189 слов

«Обработка звука с помощью ПК»

... просмотра MIDI дорожек: редактирование музыки в реальном времени используя графическое представление информации, высокое разрешение редактора (15360 пульсов на четверть), практически не лимитированное количество ... помогают представить аудио данные удобнее, чем обычные редакторы, а также внимательно изучить их с помощью различных инструментов, таких как FFT-анализаторы (построители динамических ...

Также используют ДНК-полимеразу фага Т4. Ей присущи те самые активности, что и фрагменту Кленова, но ее 3′-экзонуклеазную активность в 200 раз выше. Соответственно, эту полимеразу применяют для ввода метки к рестриктам с выступами 3′-концов.

ДНК-лигаза представляет собой еще один из важнейших инструментов генной инженерии. Она катализирует синтез фосфодиэфирной связи между 5′-фосфатным и 3′-гидроксильными концами в месте одноцепочечного разреза (ника) в двухцепочечной молекуле ДНК. Чаще используют ДНК-лигазу фага Т4, которая способна в присутствии АТР сшивать фрагменты ДНК с липкими концами: два взаимно комплементарные липкие концы образуют двойную спираль с двумя никами, которые зашиваются лигазой.

Для синтеза ДНК на РНК-матрице используют РНК-зависимую ДНК-полимеразу – обратную транскриптазу. Название фермента связано с тем, что он катализирует реакцию, обратную первому этапу экспрессии гена – транскрипции, первичным продуктом реакции является гибрид РНК-ДНК. В генной инженерии обычно используют обратную транскриптазу из РНК-вирусов птиц. Она состоит из двух субъединиц и имеет по меньшей мере две активности: ДНК-полимеразную (может использовать как матрицу одноцепочечные РНК или ДНК); активность РНКазы Н (гидролизирует РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не атакует свободной РНК).

Таким образом, фермент синтезирует на РНК-матрицы комлементарную молекулу ДНК (кДНК).

Среди других разнообразных ферментов, используемых в генной инженерии, следует упомянуть терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу, которая может наращивать нуклеотиды на 3′-конец одноцепочечной молекулы ДНК. С ее помощью можно «подтупить» концы ДНК (если 3′-конец короче) или продлить одноцепочечные 3′-концевые выросты (безматричный синтез ДНК – используются нуклеотиды, имеющиеся в реакционной смеси).

2.2 Клонирование ДНК

Методами клонирования любые фрагменты ДНК, полученные посредством рестриктаз, можно встроить в плазмиду или ДНК бактериофага – вектор для молекулярного клонирования, а затем размножить эти генетические элементы в клетках бактерий или дрожжей, увеличивая их количество в миллионы раз.

Необходимость использования вектора обусловлена ​​тем, что при обычном введении ДНК в клетки она подвергается действию нуклеаз, которые расщепляют ее до нуклеотидов. Чтобы ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном, или быть способной к автономной репликации.

Как вектор для клонирования часто используют бактериальные плазмиды. Основными требованиями к плазмиде как вектору является наличие в ее составе ориджина репликации, уникального (одного на плазмиду) сайта, который узнается определенной рестриктазой, и гена устойчивости к одному из антибиотиков как селективного маркера (рис. 4).

С целью создания рекомбинантной ДНК очищенную плазмиду, содержащую единственный сайт определенной рестриктазы, обрабатывают этой рестриктазой и получают линейный вектор с липкими концами. Далее добавляют фрагмент ДНК, который был изъят с помощью той же рестриктазы. За счет комплементарного взаимодействия между липкими концами фрагмента и вектора образуется циркулярный не ковалентный комплекс двух молекул ДНК. Благодаря использованию ДНК-лигазы полинуклеотидные цепи сшиваются – образуется рекомбинантная молекула ДНК. Удобными являются плазмидные векторы, которые содержат так называемый полилинкер – участок с определенным набором уникальных рестриктных сайтов, что позволяет подобрать одну из рестриктаз, наиболее подходящую для каждого случая.

10 стр., 4582 слов

История развития Генетики

... Такое выделение двух категорий клеток имело большое положительное значение для последующего развития генетики. В. Вальдейер в1888 г. предложил термин хромосома. Работы ботаников и животноводов ... генетических различиях можно только на основании анализа большого числа особей. Первым, кто привлек внимание к математическим закономерностям в индивидуальной изменчивости, был бельгийский математик ...

Фрагменты ДНК с тупыми концами можно встроить в вектор с помощью лигазы, хотя такая реакция на порядок менее эффективна. С помощью терминальной трансферазы к 3′-концам фрагментов ДНК можно присоединить, например, одноцепочечный poly(A)-хвост, а к 3′-концам линейного вектора – poly(T).

При смешивании между комплементарными одноцепочечными концами состоится спаривание, окончательное сшивание завершает ДНК-лигаза. Таким образом можно объединять любые фрагменты с тупыми концами, независимо от способа их получения.

Рис. 4. Схема организации плазмидного вектора (ORI – ориджин репликации, ampr – ген устойчивости к ампицилину)

Ферментативным путем можно создать тупые концы на фрагментах с липкими концами. Для этого либо осуществляют удаление одноцепочечных выростов с помощью нуклеазы S1, или липкие концы застраивают с помощью фрагмента Кленова. Образовавшийся фрагмент с тупыми концами встраивают в вектор уже описанным методом.

Трансформация бактериальных клеток рекомбинантной плазмидой осуществляется обычно в растворе CaCl2 или путем электропорации (через суспензию клеток проводится короткий импульс электрического тока).

В обоих случаях повышается проницаемость клеточной стенки и рекомбинантная плазмида попадает внутрь. Далеко не все бактерии получают плазмиду при трансформации, и здесь становится полезным ген устойчивости к антибиотику: достаточно обработать бактериальную культуру этим препаратом, чтобы оставить только трансформированные клетки. Далее происходит автономная репликация плазмиды и размножения самых клеток, что приводит к значительному росту общего количества плазмид (рис. 5).

Клонированные плазмиды выделяют из бактериальной культуры, а обработка их той же рестриктазой, которая была использована при изготовлении рекомбинантной молекулы, позволяет вырезать из вектора клонированный фрагмент ДНК.

Рис. 5. Размножение рекомбинантной плазмиды в бактериальных клетках

Наиболее распространенными плазмидными векторами сегодня являются искусственные плазмиды – производные от плазмиды pUC (pBluescript, pGEM).

Это небольшие (~ 2,7 тыс. пар оснований) мультикопийные плазмиды, содержащие ген устойчивости к антибиотику, ориджин и полилинкер, встроенный в ген lacZ. Полилинкер сам по себе не влияет на экспрессию этого гена, продуктом которой является фермент, который превращает определенный синтетический субстрат на соединение синего цвета. Если фрагмент ДНК встраивается в полилинкер, это нарушает экспрессию гена lacZ, и можно легко отбирать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную ДНК.

Чем меньше плазмида по размеру, тем она стабильнее, а следовательно, и трансформация бактерий плазмидами эффективнее. Соответственно, существует ограничение в размере фрагментов, которые можно клонировать описанным путем – до 10 тыс. пар оснований. Альтернативной, но вполне аналогичной техникой, позволяющей работать с фрагментами длинной примерно 20 тыс. пар оснований, является клонирование ДНК с использованием векторов на основе бактериофага λ. С помощью рестриктазы фрагмент ДНК встраивается в фаговую ДНК, добавляются пустые фаговые оболочки, и осуществляется сборка фаговых частиц in vitro. Рекомбинантными бактериофагами заражают бактериальную культуру, где происходит их размножение.

11 стр., 5262 слов

Генетика декоративных крыс

... делать прогнозы и на основании только одного помёта, но для исключения случайностей более точно вероятность рассчитывают исходя из большого количества помётов. Окрасы крыс Декоративные крысы имеют огромное число ... свою очередь, опирается на достижения и методы многих ее отраслей. Основные задачи генетики следующие: изучение механизма изменения гена, репродукции генов и хромосом, действия генов и ...

Используя векторы на основе космид, можно клонировать фрагменты ДНК до 40 тыс. пар оснований. Космидой является плазмида, которая кроме ориджина, сайтов рестрикции и генов устойчивости к антибиотикам содержит два так называемых cos-сайта: липкие концы линейной молекулы ДНК бактериофага λ. Именно за счет cos-сайтов линейная молекула фаговой ДНК циркуляризируется после ее проникновения в бактериальную клетку. В линейную космиду с такими липкими концами встраивается фрагмент ДНК, который желательно клонировать. Рекомбинантная космида упаковывается in vitro в фаговые частицы, которыми обрабатывают бактериальную культуру. В этом случае бактериофаг используется как эффективное средство трансформации: линейная космида проникает в клетку, где за счет cos-сайтов и бактериальной лигазы циркуляризуется. Далее циркулярная космида размножается, как обычная плазмида по схеме на рис. 5.

Для клонирования фрагментов ДНК от 100 тыс. пар оснований разработанны специально сконструированные векторы ВАС и YAC. BAC-векторы созданы на основе F-плазмид бактерий. YAC-вектор представляет собой искусственную дрожжевую минихромосому, содержащую центромеру, теломеры и точку начала репликации. В такой вектор можно ввести чужеродный фрагмент ДНК размером более 100 тыс. пар оснований, и такая минихромосома, введеная в дрожжевую клетку, будет реплицироваться и вести себя аналогично другим дрожжевым хромосомам при митотическом делении.

Большинство современных векторных систем полифункциональные, т.е. пригодны не только для клонирования ДНК, но и для экспрессии рекомби-нантных белков.

2.3 Геномные библиотеки

Для того, чтобы работать с определенным участком ДНК (например, определенным геном) сначала осуществляют клонирование большого количества разнообразных фрагментов генома – создают библиотеку клонов, среди которых уже ищут нужный.

Стандартная процедура создания библиотеки – метод дробовика (shotgun) – начинается с частичной (в течение ограниченного времени) обработки всей геномной ДНК определенной рестриктазой – так, чтобы получить набор различных перекрывающихся фрагментов определенной средней длины (рис. 9).

Все такие фрагменты встраиваются в векторы, после чего осуществляется трансформация. Бактерии высеваются на твердой среда таким образом, чтобы каждая колония вела происхождение от одной клетки. Итак, набор колоний – это набор разнообразных клонов, каждый из которых содержит один из фрагментов генома.

Рис. 9. Метод дробовика

Аналогично геномных библиотек создают библиотеки клонов кДНК. Для этого сначала выделяют суммарную мРНК из клеток определенного типа. Используя обратную транскриптазу и oligoT, которые комплементарны к 3′-концевых polyA-хвостов мРНК, как праймеры, на этих мРНК синтезируют комплементарные цепи ДНК. Далее полученные молекулы кДНК подвергают клонированию. В отличие от геномной, библиотека клонов кДНК содержит только кодирующие последовательности (экзоны) генов и только таких генов, которые являются активными в клетках данного типа.

5 стр., 2470 слов

По биологии «Основоположник учения о наследственности Грегор Мендель»

... и культурной жизни Моравии. Помимо богатой библиотеки, он имел коллекцию минералов, опытный садик и гербарий. Монастырь патронировал школьное образование в крае. 1.2 Монах-преподаватель Будучи монахом, Мендель ... Грегора Менделя 2.1 Опыты над гибридами гороха С 1856 Мендель начал проводить в монастырском садике (шириной в 7 и ... Менделя. III . Понятие генетики 3.1 Наследственность и изменчивость Генетика ...

Нужную нуклеотидную последовательность среди библиотеки клонов можно найти с помощью гибридизации клонированного ДНК из радиоактивно меченым ДНК-зондом (рис. 10).

Колонии бактерий в чашке Петри переносят на нитроцеллюлозный фильтр – делают своеобразную реплику. Затем осуществляют лизис клеток, депротеинизацию и денатурацию ДНК в щелочном растворе. После высушивания фильтра одноцепочечную ДНК необратимо фиксируют на нем. Фильтр обрабатывают радиоактивно меченой ДНК определенной последовательности – зондом. Если зонд комплементарный ДНК клона, происходит гибридизация – ренатурация двухцепочечной ДНК. Детектирование этого факта с помощью авторадиографии позволяет идентифицировать разыскиваемый клон.

Рис. 10. Гибридизация клонированной ДНК с радиоактивным зондом на нитроцеллюлозном фильтре

Синтез зонда чаще проводят, используя базу данных EST (Expressed Sequence Tag).

База является общедоступной коллекцией большого количества коротких (200-400 пар оснований) фрагментов последовательностей кДНК многих организмов. Достаточно найти в EST-базе короткий участок, отвечающий фрагменту последовательности белка (ген которого разыскивается), и синтезировать ее, чтобы приготовить зонд.

Секвенирование каждого из фрагментов, которые содержатся в геномной библиотеке клонов, и сравнение последовательностей перекрывающихся фрагментов, позволяет разместить клонированные фрагменты в порядке их локализации в геноме, то есть установить полную последовательность генома.

1. Албертс Б. Молекулярная биология клетки. В 3 т. 2-е изд., перераб. и доп. Т. 1. Пер. с англ. / Б. Албертс, Д. Брей, ДЖ. Льюис, М. Рэфф, К. Роберте, Дж. Уотсон – М. : Мир, 1994. – 517 с., ил.

2. Бакай А.В. Генетика: учеб. и учебные пособия для высших учебных за-ведений / А. В. Бакай, И. И. Кочиш, Г. Г. Скрипниченко. – М. : КолоС, 2007. – 448 с.

3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов – М. : ООО «Медицинское информационное агентство», 2005. – 736 с.

4. Гинтер Е.К. Медицинская генетика / Е.К. Гинтер – М. : Медицина, 2003. – 449 с.

5. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак – М. : Мир, 2002. – 589 с., ил.

6. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы: Пер. с англ. / Д. Гло-вер – М. : Мир, 1989. – 368 с., ил.

7. Грайфер Д.М. Биосинтез белка. Учебное пособие / Д.М. Грайфер, Н.А. Моор – Новосибирск: НГУ, 2011. – 104 с.

8. Дейвис К. Анализ генома. Методы / К. Дейвис – М. : Мир, 1990. – 246 с.

9. Дожбанский Ф. Генетика и происхождение видов / Ф. Добжанский – М. : Институт компьютерных исследований, НИЦ «Регулярная и хоатическая ди-намика», 2010 г. – 384 с.

10. Иванов В.И. Генетика / В.И. Иванов – М. : ИКЦ «Академкнига», 2006. – 638 с.

11. Камкин А.Г. Физиология и молекулярная биология мембран клеток / А.Г. Камкин, И.С. Киселева – М. : Издательский центр «Академия», 2008. – 592 с.

12. Колесников С.И. Общая биология / С. И. Колесников – Спб. : Феникс, 2006 г. – 288 с.

13. Куланина С.В. Молекулярная биология: Учебно-методический ком-плекс / С.В. Куланина – Елабуга: ЕГПУ, 2010. – 16 с.

14. Малинецкий Г.Г. Вычисления на ДНК. Эксперименты. Модели. Алго-ритмы. Инструментальные средства / Г.Г. Малинецкий, С.А. Науменко – М. : «Препринт ИПМ № 57’», 2005. – 41 с.

5 стр., 2055 слов

Почему необходимо изучать биологию? Биология — наука о жизни

... изучением происхождения и временными изменениями в разнообразии форм жизни. Генетика изучает наследственность, молекулярная биология – молекулы, физиология — функции организмов и их частей, зоология — животных, в том числе ... Именно поэтому я думаю, что каждый должен знать этот предмет в идеале. Мы живём по законам биологии, и существовать отдельно от этой науки мы не можем. ...

15. Притчард Д. Дж. Наглядная медицинская генетика / Дориан Дж. Притчард, Брюс Р. Корф – М. :ГЭОТАР-Медиа, 2009 г. – 2000 с.

16. Савченко В.К. Ценогенетика. Генетика биотических сообществ / В. К. Савченко – М. :Беларуская Навука, 2010 г. – 295 с.

17. Уиллет Эдв. Генетика без тайн / Эдв. Уиллет – Спб. : Эксмо, 2008 г. – 224 с.

18. Шевченко В.А. Генетика человека. Учебник для студентов ВУЗов / В.А. Шевченко, Н.А. Топорнина, Н.С. Стволинская – М. : ВЛАДОС, 2004. – 240 с.

19. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: учеб.-справ. пособие. – 2-е изд., испр. и доп. / С.Н. Щелкунов – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. – 496 с., ил.

20. Яковлев В. В. Популяционная генетика человека. Издание второе / В.В. Яковлев – Томск: Оптимум, 2005. – 72 с.