Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

Реферат

бактериологический микроорганизм посев морфологический

Бактериологический метод исследования является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. От правильного его выполнения зависит определение этиологического фактора, который вызывал заболевание, и, соответственно, выбор тактики лечения инфекционного больного. Важность этого метода объясняется тем, что во многих случаях врачи имеют дело с микробными ассоциациями, тогда необходимо устанавливать роль каждого из микробов в возникновении болезни.

Потому перед освоением основных принципов и методов выделения чистых культур необходимо овладеть техникой посевов и пересеваний бактерий в жидких и на плотные питательные среды.

Техника посевов микроорганизмов

Посевы проводят как с целью выделение возбудителей из исследуемого материала от больных, так и для нагромождения чистых культур с целью последующего их изучения и идентификации. Техника посевов в жидких и на плотные питательные среды имеет свои особенности.

В левую руку берут две пробирки. В одной находится питательная среда (плотное или жидкое), в другой — исследуемый материал. Пробирки зажимают большим и указательным пальцами. Для того, чтобы можно было наблюдать за содержанием пробирок, их держат сверху кисти руки. Пробирки должны быть кое-что наклоненными, и нужно следить, чтобы при открытии их материал или посторонние микробы зповитря и окружающих предметов из одной не попали в другую. Пробки из пробирок вынимают, держа их 4 и 5 пальцами правой руки. Тремя другими пальцами правой руки, как карандаш, держат бактериологическую петлю или пипетку, которыми распределяют исследуемый материал.

Сначала стерилизуют петлю в верхней части пламени газовой горелки. Пробирки открывают и край их проносят через пламя горелки. Петлю опускают в пробирку, где есть исследуемый материал, и, осторожно касаясь стенки, охлаждают. В последующем петлю опускают в пробирку и набирают материал. Если он находится в жидком состоянии, для посева достаточно капли жидкости, которая задерживается в кильке бактериологической петли. Когда используют микробов, которые выросли на поверхности среды, осторожно плавным движением набирают небольшое количество их, следя, чтобы не повредить питательную среду. Петлю медленно вынимают из пробирки, не касаясь ее стенок, и переносят в другую пробирку со средой. Штриховыми движениями от одной стенки пробирки к другой, начиная с нижней части среды, проводят занял материалу по скошенной поверхности агара снизу кверху.

22 стр., 10534 слов

Бизнес-планирование финансового оздоровления предприятия (на ...

... основные стадии производственного процесса: план закупок, продаж, производственную программу, сметы затрат сырья, материалов, заработной платы и другие стадии. Цель мастер-бюджета - выработать общий стратегический план ... усилить своё влияние на работу предприятия. Период вживания нового предприятия в рыночной среде проходит несколько этапов: Первые два года становление, оп ределение и закрепление в ...

Петлю вынимают из пробирки, пробки и края пробирок проносят через пламя и закрывают. Петлю прожаривают в пламени, чтобы уничтожить микроорганизмы.

При посеве материала на жидкую питательную среду петлю с материалом окунают в жидкость. Если он не снимается из петли, его осторожно растирают на стенке пробирки и омывают средой.

Материал, который набирали пастеровской или градуированной пипеткой, выливают в питательную среду, а для равномерного распространения его пробирку осторожно, чтобы не замочить пробку, стряхивают или вращают, зажав в ладонях.

Для посева материала на плотную питательную среду в чашках Петри небольшое количество материала набирают стерильной петлей и втирают в поверхность среды возле края чашки.

После этого петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить избыток материала, охлаждают. Следующий этап посева начинают с места, где закончился предыдущий. Петлю кладут горизонтально на поверхность агара, где было сделано занял, проводят один-два разы по поверхности и делают занял по остальным среды. Необходимо пытаться, чтобы штрихи посева длились от края к краю чашки, не повреждали поверхности агара и располагались близко друг к другу. Этим искусственно продлевается линия посева и создаются возможности для получения изолированных колоний.

Посев шпателем и тампоном в чашки Петри

Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой. Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. Осторожными круговыми движениями, держа чашку полузакрытой, распределяют материал равномерно по поверхности среды.

Посев шпателем

При посеве тампоном чашку кое-как открывают одной рукой, тампоном касаются поверхности агара возле края чашки и начинают проводить движения штрихами от края к краю чашки, втирая осторожно материал в поверхность среды, не повреждая его, постепенно вращая тампон. После проведения посева чашку вращают на 90°и повторяют перпендикулярно к предыдущему.

При посеве уколом в столбик питательной среды, Посев материала в толщу питательной среды

механическом

Выделение чистых культур микроорганизмов

Выделение отдельных видов микроорганизмов и получение чистой культуры является основой всей бактериологической работы. Чистой культурой микроорганизма называют популяцию, состоящую из особей одного вида. При выделении чистых культур из исследуемого материала, содержащего смесь микробов, используют методы, подразделяющиеся на две основные группы:

1. Методы, основанные на принципе механического разделения микробов.

2. Методы, основанные на биологических особенностях самих микроорганизмов.

Методы механического разделения микроорганизмов (методы разбавления)., Метод Пастера

Метод Коха.

Метод Дригальского (метод фракционного посева)., Метод фильтрации, Методы выделения культур, основанные на биологических особенностях микроорганизмов., Метод нагревания исследуемого материала, Метод Шукевича, Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ, Метод обогащения, Биологический метод, Этапы выделения чистых культур микроорганизмов

микроорганизмов

57 стр., 28019 слов

Воспитание нравственных качеств младших школьников (на материале ...

... методически обеспечить воспитание нравственных качеств младших школьников на материале предмета «Литературное чтение». Задачи : 1. Раскрыть сущность понятий «нравственное воспитание», «нравственная культура». 2. Охарактеризовать основные формы и методы в воспитании нравственной культуры младших школьников. 3. Экспериментально подтвердить ...

(1 этап исследования)

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

(2 этап исследования)

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалинови, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний — важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

Характеризовать колонии можно за разными признаками. За величиной (диаметром) их разделяют на больших (4-6 мм и больше), средних (2-4 мм), мелких (1-2 мм), карликовых или точечных (меньше 1 мм).

Форма колоний может быть самой разнообразной: правильно круглая, неправильная (амебоподибна), ризоидна. Они бывают прозрачными, что пропускают светло, и мутными.

За рельефом и контуром формы в вертикальном разрезе колонии разделяются на плоских, выпуклых, куполообразных, краплеподибни, конусообразные, плоскоопукли, плоские, что стелются по поверхности среды, с вдавленным центром, из припиднятой в виде соска серединой.

Поверхность колоний может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой. Гладкие и блестящие колонии помечают как S-формы (smooth — гладкий и блестящий), а шершавые — R-формы (rough — шершавый, неравный).

Форма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, бородавчатой, шагреневой, иметь радиальную исчерченность и тому подобное.

Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигментом, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и тому подобное.

При доторканни к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и тому подобное.

Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают за методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижную бактерий в “висячей” или “раздавленой” капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов.

Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 часов.

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает микробиологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

8 стр., 3644 слов

Влияние состояние окружающей среды на здоровье человека

... влияния шума на здоровье человека. Их исследования показали, что шум наносит ощутимый вред здоровью человека, ... окружающей среды. Так, в районах, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате Чернобыльской катастрофы, заболеваемость среди населения особенно детей, увеличилась во много раз. Медики установили прямую связь между ростом ... воздуха, содержащего болезнетворные микроорганизмы. К таким ...

На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных.

Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не изменяться или приобретает цвет пигмента. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов.

Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы пигмента не образуют, осадок имеет сирувато-билий или желтоватый цвет. Подобным чином растут, как правило, анаэробные бактерии.

Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной.

Аеробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влага, толстая, иметь вязанку, слизистую консистенцию и прилипать к петле, тянется за ней. Однако, встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами.

В случае необходимости изготовляется мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний.

(3 этап исследования)

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их роста можно сделать вывод о виду выделенных возбудителей. Определение вида бактерий за их морфологическими признаками называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей за их культуральными признаками называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фибринолизина, восстановление нитратов в нитритыи тому подобное. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.).

Изучение морфологических и культуральных свойств.

1) Изучение морфологических свойств микроорганизмов.

Изолировав чистую культуру микроорганизма, необходимо определить ее видовую принадлежность. Для этого проводят изучение целого ряда свойств выделенных животных (морфологических, культуральных, биохимических).

18 стр., 8613 слов

Музыкально обогащенная среда как средство развития эмоциональной ...

... возраста посредством музыкально обогащенной среды 1.1 Музыка - как средство всестороннего развития ребенка Великий ... все виды деятельности ребенка. Огромную роль в обогащении эмоционального опыта ребенка играет музыка. Музыка - ... основы разнообразных качеств и свойств в формирование личности ребенка, ... как классической, так и хорошей эстрадной и детской музыки. Во-вторых, процесс слушания музыки ...

Для идентификации организмов изучают также антигенные свойства. При установлении вида патогенных бактерий обязательно определяют патогенность на лабораторных животных. Совокупность всех свойств, признаков, особенностей микроорганизмов называют биологическими свойствами.

Морфологические свойства изучают путем микроскопии окрашенных препаратов, приготовленных из исследуемых молодых культур, выделенных на плотных или жидких питательных средах. Молодыми культурами для большинства мезофильных микробов считают 1-2-суточные, выращенные при температуре 37°С, а выращенные культуры при 20°С исследуют не позже 2 суток. При описании морфологических свойств необходимо отметить состав питательной среды, температуру роста микроба и возраст культуры. При этом отмечается форма микробных клеток наличие, характер их расположения, размер, наличие спор (их расположение), капсул, наличие инволюционных форм, а также тинкториальные свойства т.е. способность микроорганизмов окрашиваться анилиновыми красителями и по методу Грама.

При изучении морфологических свойств параллельно определяют и чистоту культуры. Кроме просмотра окрашенных мазков определяют наличие жгутиков путем исследования подвижности микробов в препаратах висячая или раздавленная капля, а также путем посева культуры в полужидкий мясопептонный агар (подвижные бактерии вызывают помутнение агара, а неподвижные растут по линии укола).

Характеристика препарата:

1. Чистота культуры: чистая

2 Форма микробных клеток: кокки

3. Величина бактерий: мелкие

4. Характер расположения: кокки, стафилококки

5. Тинкториальные свойства (окраска по Граму): положительная

6. Наличие спор: нет

2) Изучение культуральных свойств микроорганизмов.

Этот этап представляет собой изучение особенностей их роста на плотных, полужидких и жидких средах при определенных условиях.

Характер роста на плотной питательной среде изучают с подробным описан формы, величины, прозрачности, цвета, поверхности, рельефа, консистенции краев и структуры колоний, образованных на МПА, также изучают характер роста по линии укола при посеве в столбик МПЖ. Бактерии каждого вида формируют колонии с определенными признаками, которые учитывают при идентификации.

Характеристика колонии на плотной среде (МПЖ):

1. Форма колонии: круглая с фестончатым краем

2. Диаметр колонии: 2-3 мм

3. Цвет колонии: бело-желтый

4. Рельеф: плоско-выпуклый

5. Поверхность колонии: гладкая

6. Характер краев: фестончатые, с небольшими неровностями

7. Структура колонии: гомогенная

8. Консистенция: кашеобразная

9. Блеск: присутствует

10. Прозрачность: полупрозрачная

Характеристика в жидкой среде (МПБ):

1. Степень помутнения: слабое

2. Наличие пленки на поверхности: тонкая, нежная

3. Наличие пристеночного кольца: слабо выражено

4. Наличие осадка: хлопьевидный

5. Цвет среды: желтый.

3.Изучение биохимических свойств.

У микроорганизмов разных видов в пределах рода есть общие (родовые) и специфические для отдельных видов ферменты. В связи с тем, что каждый вид микробов характеризуется важнейшим этапом идентификации микроорганизмов.

6 стр., 2520 слов

Органические продукты питания: значение, польза для здоровья

... годы наблюдается рост производства генетически модифицированных продуктов питания. Тем не менее, отсутствие надлежащей маркировки этих продуктов вызывает обеспокоенность среди людей, побуждая их выбирать экологически чистые продукты. Исходя из этих моментов, очевидно, ...

О наличии того или иного фермента судят по способности микроорганизма воздействовать на известный субстрат. Присутствие фермента выявляют по изменению физического состояния субстрата (разжижению желатина), закислению питательной среды (среды Гисса с углеводами).

Образованию определенных продуктов метаболизма (индол, аммиак, сероводород) и т.д.

Ферментативная активность микробов чрезвычайно разнообразна. Она зависит от характера и количества ферментов, которые микробная клетка продуцирует и выделяет во внешнюю среду.

При изучении ферментативной активности микробов наибольшее значение придают определению сахаролитических, протеолитических, липолитических и окислительно-восстановительных ферментов, активирующих соответственно расщепление углеводов, белков липидов и редуцирующих некоторые органические красители.

Выявление сахаролитической активности. Сахаролитическую активность изучают по образованию микроорганизмами экзоферментов карбогидраз (глюкозидаз), по интенсивности образования органических кислот и ароматических веществ. Сахаролитическая способность микробов определяется по ферментативному расщеплению моносахаридов, полисахаридов, многоатомных условно именуемых «сахарами» на альдегиды, органические кислоты и газообразные продукты (углекислый газ, метан, водород).

Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и вода.

Для определения способности микроорганизмов расщеплять сахара используют специальные дифференциально-диагностические среды жидкие, полужидкие и плотные питательные среды. При отсутствии у микробов какого-либо фермента углеводы не расщепляются, индикатор остается в обесцвеченной форме, цвет среды не изменяется. Если под действием ферментов микробов углевод сбраживается, о образуется органическая кислота, которая вступает в реакцию с веществами, обесцвечивающими индикатор (со щелочью или розоловой кислотой) и нейтрализует их. В результате этого происходит восстановление цвета индикатора и окрашивание среды в розово-малиновый (с индикатором Андреде) или голубой (с индикатором «ВР») цвет.

Для выявления сахаролитических ферментов исследуемую культуру засеивают в среду Гисса, которая содержит 5 моноуглеводов: глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу. Сахара и спирты, используемые для сред Гисса, должны быть химически чистыми.

Результат: Цвет среды изменился, значит есть фермент, под действием которого расщепляется углевод — рН среды меняется, а индикатор изменяет сцвет.

Изучение протеолитических свойств микробов

Некоторые микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты — протеазы, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, альбумозы, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада белка (индол, сероводород, аммиак и др.)

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру засеивают в питательную среду, содержащий тот или иной белок (МПЖ, молоко, свернутую кровяную сыворотку).

Протеолитическая активность микробов на желатине определяется по разжижению столбика желатина под действием фермента желатиназы разжижение желатина может быть послойное, воронкообразное, в виде чулка.

В молоке микробы, выделяющие протеолитические ферменты, через несколько дней вызывают свертывание и пептонизацию молока. Пептонизация сопровождается отделением молочной сыворотки, растворением сгустка казеина под действием фермента казеиназы и выпадением осадка.

33 стр., 16296 слов

Молоко и молочные продукты

... города Каменки. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 1) Значение молока как продукта питания молоко питание химический кисломолочный МОЛОКО - полноценный и полезный продукт питания. Оно содержит все необходимые для жизни ... после рождения. Состав молока различных млекопитающих в целом определяется теми условиями окружающей среды, в которых происходит рост молодого организма. Это особенно четко проявляется в ...

Для идентификации видов существенное значение имеет выявление способности микробов гидролизовать белок до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, аммиака.

Индол (орто-бензопирил) образуется при расщеплении ферментом триптофаназой сложной гетероциклической аминокислоты триптофана.

Источниками образования сероводорода могут быть различные соединения среды: органические (цистеин, цистин, метионин) и неорганические (сульфиты, сульфаты, тиосульфата).

Для определения образования сероводорода делают посев в пробирку с МПБ, в которую под пробку над средой помещают кусочек стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. Если исследуемая культура при разложении белка выделяет сероводород, то образуется сульфид свинца, в результате чего появляется темно-бурое окрашивание фильтровальной бумажки. Присутствие аммиака определяют по изменению цвета красной лакмусовой бумажки (синеет), а также при помощи реактива Несслера.

Результат: Сделав посев в МПБ, дополнительно поместив под пробирку кусочек стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца, наблюдается выделение сероводорода, а вследствие этого наблюдается потемнение бумажки, т.е. сероводород является продуктом жизнедеятельности этих микроорганизмов.

Определение видов бактерий

Выполнив посев и изучив морфологические, культуральные и биохимические свойства данного вида микроорганизмов, проанализировав их, я сделал вывод, что наиболее подходят под описание кокки рода Staphilococcus, вида Saprophyticus.

Характеристика вида:

Кокки, располагаются группами в форме виноградной грозди, грамположительные, каталазоположительные, факультативные анаэробы, хорошо размножаются на простых питательных средах и быстро размножаются на средах с большой концентрацией NaCI (ЖСА), образуя на плотных питательных средах семейства с белым, желтым или золотистым пигментом. Обладают хорошо выраженными протеолитическими свойствами: разжижают желатин, свертывают и пептонизируют молоко, вызывают гемолиз, выделяют аммиак, сероводород.

Список используемой литературы

[Электронный ресурс]//URL: https://litfac.ru/referat/metodyi-vyideleniya-chistyih-kultur/

1.Дикий.И.Л., Сидорчук И.И., Холупяк И.Ю. и др. Микробилогия: Руководство к лабораторным занятиям: Учебное пособие для студентов фармацевтических ВУЗов и фармацевтических факультетов медицинских институтов. // К.: ИД “Профессионал”, 2004. — С.

2.Джавец Э., Мельник Дж. Л., Эйдельберг Э.А. Руководство по медицинской микробиологии. 1-ый т. Пер. с англ. — М.: Медицина, 1982.

3.И.Л. Дикий и соавт. Микробиология. Харьков, 1999.-С. 50-60., 138-142

4 П.П.Степаненко «руководство к лабораторным работам по микробиологии молока и молочных продуктов». Москва 2005 г.

5 П.П.Степаненко «Микробиология молока и молочных продуктов». Учебник для студентов вузов, Москва 2003 г.

6 «Определитель бактерий» Берджи.

4 стр., 1812 слов

Роль отечественных ученых в развитии микробиологии

... … Роль отечественных ученых в развитии микробиологической науки. Вклад Мечникова в развитие иммунология. Илья Мечников внес весомый вклад в развитие таких наук, как сравнительная эмбриология, микробиология, иммунология, геронтология, антропология. В историю мировой биологической ...

7.П.П. Стенанеико, Р.П. Корнелаева «Микробиология молока и молочных продуктов. Методы выделения чистых культур и идентификации вида бактерий» Москва 2002 г.

8.Руководство к практическим заняттям по медицинской микробиологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней /Под ред. Проф. Кривошеина Ю.С. — К.: Вища школа, 1986. — С. 25-31.